На главную страницу || e-mail


М.Б.Жилова, Н.Л.Каганова А, Н.В.Фриго, Л.Ф.Знаменская, И.А.Волков, В.А.Волнухин

Выбор генов, ассоциированных с эксцизионной системой репарации ДНК. Разработка протокола исследования для изучения прогнозирования эффективности и безопасности ультрафиолетовой терапии больных псориазом

(опубликовано: Вестник дерматологии и косметологии, Москва, ООО «Дэкс-Пресс», 2009 г., №6, стр. 59-66)

В статье представлены результаты первого этапа научно-исследовательской работы, выполняемой в соответствии с Государственным контрактом 02.512.11.2323 от 05.05.2009 г. (шифр 2009-02-1.2-04-35-007) Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» Федерального агентства по науке и инновациям Министерства образования и науки Российской Федерации. Целью научно-исследовательской работы является разработка нового подхода к выбору тактики фототерапии больных псориазом (выбор вида и длительности ее проведения), прогнозированию ее эффективности и безопасности на основе выявления в биообразцах, полученных от больных псориазом, клинически значимых мутаций генов, ассоциированных с эксцизионной системой репарации ДНК. На первом этапе исследования были отобраны для изучения гены, ассоциированные с эксцизионной системой репарации ДНК: ХРС, XPD и XPF; определены в наибольшей степени функционально значимые участки указанных генов: фрагмент 15-го экзона гена ХРС, фрагмент 9-го экзона гена XPD и фрагмент 11-го экзона гена XPF; разработан Протокол, включающий клинический и экспериментальный разделы и подробное описание проведения исследования; на 20 биообразцах здоровых добровольцев и 34 биообразцах больных псориазом осуществлена апробация методов выделения ДНК, амплификации и секвенирования ДНК выбранных генов, показавшая их удовлетворительную воспроизводимость. По предварительным данным, при секвенировании ДНК функционально значимых участков генов ХРС, XPD и XPF у больных псориазом и здоровых добровольцев обнаружены следующие замены нуклеотидов: в гене XPD - в позициях 6491 и 12514; в гене ХРС - в позициях 32724, 32828, 33343, 33350 и 82864; в гене XPF - в позициях 27945 и 28095.
Ключевые слова: псориаз, ультрафиолетовая терапия, гены ХРС, XPD и XPF, эксцизионная система репарации ДНК, мутация, секвенирование.

Об авторах:
М.Б.Жилова - заведующая отделением физиотерапии ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», к.м.н.
Н.Л.Каганова - младший научный сотрудник ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий»
Н.В.Фриго - гл. научный сотрудник ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», д.м.н.
Л.Ф.Знаменская - заведующая отделом дерматологии ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», к.м.н.
И.А.Волков - научный сотрудник ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», к.б.н.
В.А.Волнухин - ведущий научный сотрудник ФГУ «ГНЦД Росмедтехнологий», д.м.н.


В последние годы в Российской Федерации отмечается рост числа хронических дерматозами больных. Так, в 2004 г. зарегистрировано 8 739 070 случаев заболеваний кожи и подкожной клетчатки (6124,5 на 100 000 населения), в 2005 г., 2006 г., 2007 г. и 2008 г. - соответственно 8 850 018 (6234,1 на 100 000 населения), 9 096 106 (6383,9 на 100 000 населения), 9 046 672 (6362,0 на 100 000 населения) и 8 972 641 случаев (6318,4 на 100 000 населения).

В современной дерматологической практике лечение больных тяжелыми формами распространенных и социально значимых заболеваний кожи проводится в рамках государственного задания на оказание высокотехнологичной медицинской помощи. Среди этих больных 60-70% составляют пациенты, страдающие псориазом, большинство которых в течение длительного времени получают повторные курсы фототерапии.

В настоящее время методы фототерапии нашли широкое применение в терапии хронических заболеваний кожи, в том числе псориаза. Способность того или иного вида излучения проникать в кожу человека зависит от длины волны, что важно учитывать при фототерапии ряда хронических дерматозов, при которых патологический процесс локализуется в различных слоях кожи. Так, средневолновые лучи (УФВ) поглощаются в основном эпидермисом, длинноволновые лучи (УФА) достигают сосочкового и сетчатого слоев дермы.

Одним из наиболее распространенных и эффективных методов ультрафиолетовой терапии является фотохимиотерапия (ПУВА-терапия), заключающаяся в сочетанном применении длинноволнового УФ-излучения (УФА, длина волны 320—400 нм) и фотосенсибилизаторов группы псораленов. УФА излучение достаточно глубоко проникает в кожу и оказывает действие на дермальные фибробласты, дендритные клетки, эндотелиоциты и клетки воспалительного инфильтрата (Т-лимфоциты, тучные клетки, гранулоциты). Механизм действия ПУВА-терапии до конца не выяснен [13]. Основное значение придается взаимодействию активированного фотосенсибилизатора с ДНК клеток, в результате которого образуются монофункциональные связи с пиримидиновыми основаниями, а затем бифункциональные связи и перекрестные сшивки между цепями ДНК, что приводит к торможению клеточной пролиферации за счет временного подавления синтеза нуклеиновых кислот и белка.

В последнее время широко применяется в терапии кожных болезней средневолновое УФ-излучение узкого спектра с максимумом эмиссии на длине волны 311 нм. При узкополосной средневолновой фототерапии не требуется применения фотосенсибилизаторов, в результате чего реже развиваются нежелательные побочные эффекты.

Методы УФ-терапии высокоэффективны при лечении больных разными формами псориаза, однако могут приводить к развитию ряда побочных эффектов. Выделяют ранние и отдаленные побочные эффекты. К ранним побочным эффектам относят зуд, сухость кожи и эритему. Отдаленные побочные эффекты связаны с длительным воздействием УФ-излучения и характеризуются развитием новообразований и симптомов старения кожи. Установлено, что УФ-излучение является одним из самых частых факторов, вовлеченных в патогенез раковых образований кожи [26]. Однако точная роль в развитии рака кожи УФВ и УФА излучения, а также комбинированного воздействия этими видами излучения остается до конца не выясненной.

УФВ диапазон поглощается непосредственно ДНК клетки, УФА диапазон хуже поглощается ДНК, его генотоксические эффекты связаны главным образом с индукцией окислительного стресса и окислительного повреждения компонентов клетки.

При изучении отдаленных результатов лечения 1380 больных псориазом, получавших курсы ПУВА-терапии в течение 15 лет, отмечено увеличение частоты развития меланомы кожи по сравнению с популяционной частотой [34]. При сравнении канцерогенного потенциала низких доз (менее 100 процедур или менее 1000 Дж/кв.см за все курсы лечения) и высоких доз (более 200 процедур или более 2000 Дж/кв.см) ПУВА-терапии обнаружено, что у больных, получивших более 200 процедур, частота развития плоскоклеточного рака кожи оказалась в 14 раз выше, чем у пациентов, получивших менее 100 процедур [33].

Одним из важнейших механизмов защиты от развития рака кожи является система репарации повреждений ДНК, возникающих под влиянием УФ-излучения. УФ-индуцированные повреждения ДНК эффективно устраняются системой нуклеотидной эксцизионной репарации (NER), в которую вовлечены более 20 генов [28]. Считается, что сниженная способность к репарации ДНК является фактором, предрасполагающим к возникновению рака кожи [18,44].

Роль репарации ДНК в канцерогенезе кожи была впервые продемонстрирована у больных пигментной ксеродермой [21,29], у которых имеется врожденный дефект системы репарации ДНК. При УФ-индуцированном повреждении ДНК у этих пациентов более чем в 1000 раз повышается риск развития УФ-индуцированного рака кожи по сравнению с общей популяцией. В связи с высоким уровнем заболеваемости меланомой и ранним развитием меланом у больных пигментной ксеродермой предполагается, что гены эксцизионной системы репарации ДНК могут играть определенную роль в развитии спорадической меланомы кожи. Возможно, что у пациентов с УФ-чуветвительной кожей также снижена способность к репарации ДНК [27].

Меланома является одним из наиболее злокачественных новообразований кожи, хотя встречается значительно реже, чем немеланомные раки кожи. Начиная с 70-х годов XX века увеличение числа случаев развития меланомы кожи наблюдается в США, Австралии, Новой Зеландии и южной Европе [3, 11, 22, 30]. С 1970 г. заболеваемость меланомой повысилась с 3 до 7% . В 2004 г. в США меланома кожи была диагностирована у 55 000 человек, из них 7910 человек умерли. Побочные эффекты УФ-облучения (ожоги, эритема кожи) повышают риск развития меланомы кожи [7, 35].

Первое исследование по изучению полиморфизмов генов репарации ДНК у больных меланомой кожи было проведено в Великобритании S. Win- sey и соавт. в 2000 г. [45]. Авторами была изучена связь между полиморфизмами генов репарации ДНК XRCC1, ERCC1, XPD, XPF, XRCC3 и риском развития меланомы кожи. Авторами обследованы 125 больных меланомой и 211 здоровых лиц. Установлено, что у больных, имеющих Т-аллель в позиции 18067 (кодон 241 [Thr241 Met]) в 7-м экзоне гена XRCC3, наблюдается двукратное увеличение риска развития меланомы кожи. Однако другое исследование, включавшее 305 больных меланомой и 319 здоровых лиц, проведенное в США, не подтвердило значимость полиморфизмов гена XRCC3. В более поздней работе при обследовании 56 больных меланомой кожи и 66 здоровых лиц была показана роль полиморфизмов G/A в 4-м экзоне гена ERCC1 и полиморфизмов А/С (6 экзон), С/Т (22 экзон) и А/С (23 экзон) гена XPD в повышении риска развития меланомы кожи [40].

A. Baccarelll и соавт. [2] обнаружили повышенный риск развития меланомы у больных в возрасте старше 50 лет, не имевших диспластических невусов, однако они не выявили ассоциаций между полиморфизмами (Asp312Asn в 10-м экзоне и Lys751- Gln в 23-м экзоне) гена XPD и риском развития меланомы кожи.

S. Bishop и соавт. [4,5] изучали активность систем репарации в непораженной коже больных псориазом при воздействии УФА и УФВ диапазонами. Было отмечено линейное повышение активности систем репарации ДНК при комбинированном воздействии обоими диапазонами, однако активность их не увеличивалась при воздействии только УФА излучением, на основании чего авторы делают выводы о преимущественном повреждающем действии на ДНК именно УФВ диапазона.

В исследовании М. Dybdahl проведено сравнение [15] способности к репарации ДНК у 20 больных псориазом и наличием рака кожи и 20 больных псориазом, у которых рак кожи не выявлялся. У тех пациентов, у которых способность к репаращии ДНК была значительно снижена, наблюдалось шестикратное повышение риска развития рака кожи по сравнению с больными, имевшими высокую способность к репарации ДНК. Также было обнаружено, что чем менее выраженной была у пациентов способность к репарации ДНК, тем ранее развивался рак кожи. Однако авторы не выявили различий в способности к репарации ДНК и риске развития базально-клеточного рака кожи между 20 больными базально-клеточным раком кожи и 20 здоровыми добровольцами.

В исследовании, проведенном Y. Qiao [41], у 102 пациентов без признаков рака кожи была изучена способность к репарации ДНК, а также проведено типирование генов ХРС и XPD в четырех позициях (интрон 9 в гене ХРС и позиции 156, 312 и 715 в гене XPD). Авторы предполагают, что фенотипическая и генотипическая способность к репарации ДНК модулируется генетическими полиморфизмами генов типа ХРС и XPD. Кроме того, каждый вариант генотипа может частично влиять на фенотип и, таким образом, на генетическую восприимчивость к раку. Масштабные исследования по изучению ассоциаций между генетическими вариантами гена XPD и риском развития УФ-ассоциированного рака кожи были проведены в США на выборке из 32 826 человек. У женщин, носителей полиморфизмов Lys751Lys гена ХРD, получивших высокую кумулятивную дозу солнечного облучения и имевших в анамнезе 4-5 солнечных ожогов кожи в течение жизни, было отмечено значительное повышение частоты развития меланомы и базально-клеточного рака кожи. С плоскоклеточным раком кожи ассоциации выявлено не было [Н. Jiali, 2005].

Вышеуказанные полиморфизмы (Lys751Gln и Asp312Asn) гена XPD были также обнаружены у лиц, подвергавшихся вредному воздействию мышьяка, у которых риск развития рака кожи - значительно выше, чем в общей популяции [1]. Установлено, что белок, кодируемый геном XPD, и белок р53 взаимодействуют между собой в модуляции апоптоза и эксцизионной репарации ДНК. При сохранении продуктов фотоповреждения ДНК, не удаленных системой репарации, аккумулируется белок р53 и индуцируется апоптоз клеток.

Таким образом, как показывают приведенные литературные данные, существует достаточно большое количество публикаций, указывающих на наличие взаимосвязи между состоянием эксцизионной системы репарации ДНК и риском развития злокачественных новообразований кожи под влиянием УФ-излучения, хотя точная роль в развитии рака кожи УФВ и УФА диапазонов излучения, а также комбинированного их воздействия остается до конца не выясненной.

Целью настоящего исследования явилась разработка нового подхода к выбору тактики фототерапии больных псориазом (выбор вида и длительности ее проведения), прогнозированию ее эффективности и безопасности на основе выявления в биообразцах, полученных от больных псориазом, клинически значимых мутаций генов, ассоциированных с эксцизионной системой репарации ДНК.

Научно-исследовательская работа выполнялась в соответствии с Государственным контрактом 02.512.11.2323 от 05.05.2009 г. (шифр 2009-02-1.2-04-35-007) Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 гг.»Федерального агентства по науке и инновациям Министерства образования и науки Российской Федерации.

Дизайн исследования предполагал поэтапное (4 этапа) открытое, несравнительное проспективное исследование применения различных видов УФ-терапии у пациентов со среднетяжелыми и тяжелыми распространенными формами псориаза, конечным результатом которого являлась разработка метода оценки эффективности и безопасности УФ-терапии больных псориазом на основе изучения мутаций генов, ассоциированных с эксцизионной системой репарации ДНК.

Первый этап исследования заключался в отборе генов, подверженных воздействию УФ-облучения, ассоциированных с эксцизионной системой репарации ДНК, у больных псориазом и в разработке методологии исследования.

Обоснование выбора генов, ассоциированных с эксцизионной системой репарации ДНК, подверженных воздействию УФ-облучения, у больных псориазом

Для исследования у больных псориазом генов эксцизионной системы репарации ДНК и изучения возникновения в них клинически значимых мутаций под влиянием лечения УФ-излучением были выбраны 3 гена эксцизионной репарации: ХРС, XPD и XPF. Белки, кодируемые этими генами, являются ключевыми компонентами процесса эксцизионной репарации ДНК. Так, ген ХРС кодирует белок, узнающий повреждения в ДНК, а ген XPD кодирует ДНК-геликазу — белок, который расплетает молекулу ДНК в районе места повреждения. Ген XPF кодирует белок, образующий комплекс с белком ERCC1 и участвующий в 5 -надрезании молекулы ДНК при эксцизионной репарации нуклеотидов. Мутации в данных генах могут привести к нарушению процессов репарации ДНК и соответственно к возрастанию ошибок в молекуле ДНК. УФ-облучение увеличивает риск появления мутаций, например, способствует образованию пиримидиновых димеров. Если мутации затронут гены репарации, это может иметь критические последствия как для отдельной клетки, так и для всего организма - повысится риск возникновения новообразований, включая раковые. Кроме того, внутрипопуляционный полиморфизм, обусловленный наличием SNP в последовательностях генов, может оказывать влияние на эффективность транскрипции и трансляции данных генов и процессов репарации в целом, а также на предрасположенность к ряду заболеваний.

Ввиду того, что выбранные для исследования гены эксцизионной системы репарации ДНК имеют значительные размеры, для изучения состояния каждого гена и определения его нуклеотидной последовательности были отобраны наиболее важные функциональные участки.

Для изучения гена ХРС при проведении настоящего исследования был выбран фрагмент 15-го экзона гена ХРС. В данном участке гена была обнаружена нуклеотидная замена, которая ассоциирована с высоким риском образования рака кожи. Кроме того, в исследуемый участок входит вариабельная нуклеотидная последовательность, что делает этот участок перспективным для исследования [12, 24, 42]. Для исследования гена XPD был выбран 9-й экзон. Данная область включает функциональный домен DEAH-box, который в свою очередь входит в АТФ-связывающий геликазный домен. Функция указанных доменов заключается в расплетании двуцепочечной молекулы ДНК для последующей работы репарационного аппарата. Также предполагается, что домен DEAH-box принимает участие в метаболизме РНК. В данной области также обнаружена нуклеотидная замена, для которой ассоциация с определенными заболеваниями на данный момент не установлена. Очевидно, что данная замена спо-собна изменять работу DEAH-box [12, 23, 24].

Для изучения гена XPF [ERCC4] был выбран 11-й экзон. Данный участок кодирует район белка XPF, который входит в состав домена, отвечающего за взаимодействие с белками ЕМЕ1 и ERCC1. В этой области также обнаружена нуклеотидная замена, значительно снижающая репарационную активность гена [12, 19, 32].

Разработка методологии исследования

Для обеспечения проведения исследования на первом этапе работы разработан Протокол исследования, включающий клинический и экспериментальный разделы.

Клинический раздел Протокола включает описание этапов клинико-анамнестического обследования больного псориазом, которому планируется провести от 15 до 30 процедур узкополосной (311 нм) средневолновой фототерапии или общей ПУВА-терапии.

Все обследуемые (не менее 80 больных псориазом и не менее 20 здоровых добровольцев) будут разделены на несколько групп. 1-ю группу составят 20 больных псориазом, ранее не получавших узкополосную средневолновую терапию (УФВ-311) и ПУВА-терапию. Основной целью обследования пациентов данной группы будет являться изучение ну клеотидных замен выбранных генов эксцизионной системы репарации ДНК и выявление соматических мутаций ХР-генов, которые, возможно, появятся в коже пациентов после первого курса УФ-терапии. Для проведения исследования больным будет производиться забор крови до лечения и забор биоптатов непораженной псориазом кожи после курса УФ-терапии (табл. 1).

Таблица 1. Распределение обследуемых по группам и порядок забора биоматериала для исследования

Группа пациентов
Число обследуемых
Кровь
Биоптат кожи
до лечения
после лечения
до лечения
после лечения
1-я
20
+
+
2-я
60
+
+
3-я
20
+
+

Во 2-ю группу войдут 60 больных псориазом, ранее получавших различные виды фототерапии. В данную группу будут включены пациенты, получившие в течение жизни 3 и более курсов УФ-терапии. Целью обследования пациентов этой группы является изучение влияния кумулятивного эффекта УФ-облучения на появление возможных мутаций ХР-генов после многокурсового лечения. При анализе клинической эффективности терапии больных этой группы отдельно будут выделены лица с низким терапевтическим эффектом от проводимого лечения методами фототерапии; лица с развившимися фототоксическими реакциями, а также лица, у которых развились признаки фотостарения кожи (лентиго, кератоз кожи) и/или другие осложнения фототерапии (крапчатая пигментация и др.). Для проведения исследования больным этой группы будет проводиться забор крови до лечения и забор биоптатов непораженной псориазом кожи после курса УФ-терапии. У больных, получавших длительные курсы фототерапии, забор биоптатов планируется производить с участков непораженной псориазом кожи с признаками фотостарения или других осложнений УФ-терапии. Больным с фототоксическими реакциями забор биообразцов кожи будет производиться с участков клинических проявлений фототоксических реакций после отмены курса фототерапии.

В 3-ю группу (группа сравнения) войдут 20 здоровых добровольцев, не подвергавшихся активной солнечной инсоляции, у которых будет проводиться забор крови.

Оценка распространенности и тяжести кожного процесса будет проводиться с помощью индекса распространенности и тяжести псориаза PASI, оценка эффективности терапии — на основании определения разницы значений PASI до и после лечения, выраженной в процентах. Все нежелательные явления в процессе УФ-терапии будут фиксироваться в истории болезни пациента и его индивидуальной карте.

Тяжесть нежелательных явлений, возникающих в процессе УФ-терапии, будет оцениваться по следующим критериям: В целях систематизации данных, которые будут получены в ходе исследования, разработана индивидуальная карта больного псориазом, получающего фототерапию. Карта включает разделы, касающиеся демографических данных, анамнеза жизни и болезни пациентов, результатов их клинического обследования (включая оценку индекса PASI). В карте описано общее количество процедур и курсов фототерапии, полученное в течение жизни, отмечено наличие побочных эффектов, характер получаемого пациентом лечения в настоящее время с указанием вида применяемой фототерапии, начальной, максимальной и общей дозы УФ-излучения, количества процедур и характера клинического ответа пациентов на лечение на основании разработанных критериев.

Экспериментальный раздел Протокола по исследованию нуклеотидных последовательностей выбранных генов эксцизионной системы репарации ДНК (XPD, ХРС, XPF) для поиска мутаций или нуклеотидных замен включает подбор праймеров для амплификации и секвенирования выбранных генов; выделение ДНК из биообразцов; амплификацию ДНК функционально значимых фрагментов выбранных генов; секвенирование ДНК.

Для амплификации и секвенирования функционально значимых участков генов ХРС, XPD и XPF с использованием компьютерной программы Oligo6 подобраны следующие праймеры (табл. 2).

Таблица 2. Праймеры для амплификации и секвенирования фрагментов генов эксцизионной системы репарации ДНК

Ген
Последовательность праймеров
Температура отжига, C
Размер амплифицируемого
продукта, п.н.
XPD
F: TCACCCTGCAGCACTTGGTT
R: CTGTCTCTATCCATCTGCTC
64
673
XPC
F: TCTCCTTAGTACAGAGAGCTT
R: CTGATTACTAACCCTCGCCT
64
1014
XPF
F: GAGAGTTCTTCCCCAGTGAC
R: CCTATGATGTCTGGCAAGGA
64
734

Выделение ДНК из биоптатов кожи проводится с использованием коммерческого набора реагентов DiatomTM DNA Prep 100 по следующему протоколу: гомогенизация биоптата в буфере на основе трис-HCL, ЭДТА, NaCL с добавлением додецил-сульфата натрия, лизис полученного гомогената с использованием протеиназы К, дальнейшее выделение ДНК с использованием набора реагентов DiatomTM DNA Prep 100.

Амплификация функционально значимых фрагментов выбранных генов осуществляется с помощью коммерческого набора регентов фирмы «Син-тол» (Россия). Полимерная цепная реакция (ПЦР) проводится в амплификаторе Dyad фирмы «Bio-Rad» (США).

Секвенирование ДНК проводится с помощью анализатора 3130 Genetic Analyzer фирмы «Applied Biosystems» (США - Япония) с использованием программного обеспечения Run 3130 Data Collection v 3.0; Sequencing Analysis 5.2; Seqscape v 2.5.

В целях испытания разработанного Протокола экспериментальных исследований проведено изучение молекулярной структуры функционально значимых участков генов ХРС, XPD, XPF у 20 здоровых добровольцев и 34 больных псориазом, в результате которого установлена удовлетворительная воспроизводимость исследования.

На рис. 1 представлены результаты амплификации генов XPD, ХРС и XPF пациента 1. На рис. 2 представлен фрагмент сиквенса гена XPF у пациента 1, проанализированный с помощью программы Sequencing Analysis 5.2, которая позволяет оценить первичные данные и ряд параметров, свидетельствующих о достоверности полученных результатов (общий уровень сигнала по каждому из четырех нуклеотидов, уровень фонового сигнала, степень достоверности идентификации каждого нуклеотида в сиквенсе). У данного пациента обнаружена замена нуклеотида Т на С (выделено на рис. 2) в позиции 27945 (генотип СС).
Результаты ПЦР исследуемых генов пациента 1.
Рис. 1. Результаты ПЦР исследуемых генов пациента 1.
Дорожка 1 - маркер молекулярной массы*; дорожки 2-4 - результаты амплификации генов XPD, XPC, XPF соответственно; дорожка 5 - отрицательный контроль
* Маркер молекулярной массы представляет собой набор из двадцати ДНК-фрагментов длиной 80, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1031, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 пар нуклеотидов

Фрагмент сиквенса гена XPF пациента 1.
Рис.2 Фрагмент сиквенса гена XPF пациента 1.

По предварительным данным, при секвенировании ДНК функционально значимых участков генов ХРС, XPD и XPF у больных псориазом и здоровых добровольцев обнаружены следующие замены нуклеотидов: в гене XPD - в позициях 6491 и 12514; в гене ХРС - в позициях 32724, 32828, 33343, 33350 и 82864; в гене XPF - в позициях 27945 и 28095 (табл. 3).

Таблица 3. Замены нуклеотидов, обнаруженные в генах XPC, XPD и XPF у больных псориазом и здоровых добровольцев

Ген XPD
Ген XPC
Ген XPF
6491 AA
32724 AA
27945 TC
12514 AA
 
 
 
32828 CC или GC
33343 TA
33350 AG
82864 CT
28095 GA
 
 
 

Заключение

Таким образом, в результате проведенного этапа исследования были отобраны следующие гены эксцизионной системы репарации ДНК: ХРС, XPD и XPF) определены участки генов, в наибольшей степени функционально значимые для изучения: фрагмент 15-го экзона гена ХРС, фрагмент 9-го экзона гена XPD, кодирующий функциональный домен DEAH-box и фрагмент 11-го экзона гена XPF (ERCC4).

Для обеспечения дальнейшего проведения исследований: разработан Протокол, включающий клинический и экспериментальный разделы и подробное описание проведения исследования; подобраны праймеры для выделения выбранных участков генов, ассоциированных с эксцизионной системой репарации ДНК; с участием 20 здоровых добровольцев и 34 больных псориазом проведено испытание методов выделения ДНК из биообразцов, амплификации и секвенирования генов эксцизионной системы репарации ДНК, показавшее их удовлетворительную воспроизводимость. Все это позволяет в полном объеме осуществлять проведение экспериментальных исследований биообразцов больных псориазом, получающих УФ-терапию, и здоровых добровольцев для выявления мутаций в выбранных генах эксцизионной системы репарации ДНК.

Литература:

1. Applebaum К.М. Polymorphisms in nucleotide excision repair genes, arsenic exposure, and non-melanoma skin cancer in New Hampshire / K.M. Applebaum, M.R. Karagas , D.J. Hunter , P.J. Catala no, S.H. Byler, S. Morris, H.H. Nelson // Environ Health Perspect. 2007. Aug. Vol. 115, № 8. P. 231-236.
2. Baccarelli A. XPD gene polymorphism and host characteristics in the association with cutaneous malignant melanoma risk / A. Baccarelli, D. Calista, P. Minghetti et al. // Br. J. Cancer. 2004. Vol. 90. P. 497-502.
3. Beddingfield F.C. 3rd. The melanoma epidemic: res ipsa loquitur / C. Beddingfield 3rd // Oncologist. 2003. Vol. 8. P. 459-465.
4. Bishop S.C. DNA repair synthesis in human skin exposed to ultraviolet radiation used in PUVA (psoralen and UV-A) therapy for psoriasis / S.C. Bishop // Br. J. Dermatol. 1979. Oct. Vol. 101, № 4. P. 399-405.
5. Bishop C. DNA Repair Elicited by UVB During PUVA Therapy for Psoriasis / C. Bishop and E. Abel // Arch Dermatol Res. 1985. Vol. 278. P. 25-30.
6. Bulliard J.L. Site-specific risk of cutaneous malignant melanoma and pattern sun exposure in New Zealand / J.L. Bulliard // Int J Cancer. 2000. Vol. 85. P. 627-632.
7. Cleaver J.E. A Summary of Mutations in the UV-Sensitive Disorders: Xeroderma Pigmentosum, Cockayne Syndrome, and Trichothiodystrophy / J.E. Cleaver, L.H. Thompson, A.S. Richardson, J.C. States // HUMAN MUTATION. 1999. Vol. 14. P. 9-22.
8. Coven T.R. PUVA-induced lymphocyte apoptosis: mechanism of action in psoriasis / T.R. Coven, I.B. Walters, I. Cardinale, J.G. Krueger // Photodermatol Photoimmunol Photomed. 1999. Feb. Vol. 15. P. 22—27.
9. Drane P. Selective regulation of vitamin D receptor-responsive genes by TFIIH / P. Drane, E. Compe, P. Catez, P. Chymkowitch, J.-M. Egly // Mol. Cell 2004. Vol. 16. P. 187-197.
10. Dybdahl M. Low DNA repair is a risk factor in skin carcinogenesis: a study of basal cell carcinoma in psoriasis patients / M. Dybdahl, Frentz, U. Vogel, H. Wallin, В .A. Nexo // Mutat Res. 1999. Vol. 433. P. 15-22.
11. Grossman L. DNA repair and epidemiology of basal cell carcinoma / L. Grossman and Q. Wey // Clin Chem. 1995. Vol. 41. P. 1854-1863.
12. Han J., Colditz A. Liu J. S. and. Hunter D. J. Genetic Variation in XPD, Sun Exposure, and Risk of Skin Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005. Vol. 14, № 6. P. 1539-44.
13. Hoeijmakers J.H.J Xeroderma pigmentosum group F caused by a defect in a structure-specific DNA repair endonuclease / J.H.J. Hoeijmakers, R.D Wood // Cell. 1996. Vol. 86. P. 811-822.
14. Kraemer K.H. The role of sunlight and DNA repair in melanoma and nonmelanoma skin cancer. The xeroderma pigmentosum paradigm / K.H. Kraemer, M.M. Lee, A.D. Andrews, W.C. Lambert // Arch Dermatol. 1994. Vol. 130. P. 1018-1021.
15. Lamberg L. «Epidemic» of malignant melanoma: true increase or better detection? / L. Lamberg // JAMA. 2002. Vol. 287. P. 220.
16. Lehmann A.R. The xeroderma pigmentosum group D (XPD) gene: one gene, two functions, three diseases / A.R. Lehmann // Genes Dev. 2001. Vol. 15. P. 15-23.
17. Li L. Characterization of molecular defects in Xeroderma pigmentosum group С / L. Li, E.S. Bales, C.A. Peterson, R.J. Legerski // Nat. Genet. 1993. Vol. 5. P. 413-417.
18. Ravanat J.L. Direct and indirect effects of UV radiation on DNA and its components / J.L. Ravanat, T. Douki, J. Cadet // Photochem Photobiol B. 2001. Vol. 63. P. 88-102.
19. Rees J.L. The Genetics of Sun Sensitivity in Humans / J.L. Rees // Am. J. Hum. Genet. 2004. Vol. 75. P. 739-751.
20. Sancar A. DNA repair in human / A.Sancar // Annu Rev Genet. 1999. Vol. 29. P. 69-105.
21. Setlow R. B. Evidence that xeroderma pigmentosum cells do not perform the first step in the repair of ultraviolet damage to their DNA / R.B. Setlow, J.D. Regan, J. German et al. // Proc Natl Acad Sci USA. 1969. Vol. 64. P. 1035-1041.
22. Sides BA. The melanoma epidemic. Figures have risen by over 150% over 10 years / B.A. Sides // BMJ. 1996. Vol. 312. P. 1363.
23. Sijbers A.M. Homozygous R788W point mutation in the XPF gene of a patient with xeroderma pigmentosum and late-onset neurologic disease / A.M. Sijbers, V.P.C. van Voorst, J.W. Snoek, A. Raams, N.G.J. Jaspers, W.J. Kleijer// J. Invest. Dermatol. 1998. Vol. 110. P. 832-836.
24. Stern R.S. Risk of squamous cell carcinoma and methoxsalen (psoralen) and UV-A radiation (PUVA) A meta-analysis / R.S. Stern, E.J. Lunder // Arch Dermatol. 1998. Dec. Vol. 134, № 12. P. 1582-1585.
25. Stern R.S. The risk of melanoma in association with long-term exposure to PUVA / R.S. Stern // J Am Acad Dermatol. 2001. May. Vol. 44, № 5. P. 755-761.
26.Tabenkin H. A case-control study of malignant melanoma in Israeli Kibbutzin / H. Tabenkin, A. Tamir, A.D. Sperber, M. Shapira, P. Sh- vartzman // Isr Med Assoc J. 1999. Vol. 1. P. 154-157.
27.Tomescu D. Nucleotide excision repair gene XPD polymorphisms and genetic predisposition to melanoma / D. Tomescu, G. Kavanagh, Т. Ha, H. Campbell, D.W. Melton // Carcinogenesis. 2001. Vol. 22. P. 403—408.
28. Qiao Y. Rapid assessment of repair of ultraviolet DNA damage with a modified host-cell reactivation assay using a luciferase reporter gene and correlation with polymorphisms of DNA repair genes in normal human lymphocytes / Y. Qiao, M.R. Spitz, Z. Guo // Mutat Res. 2002. Vol. 509. P. 165-174.
29. Qiao Y. Modulation of repair of ultraviolet damage in the host-cell reactivation assay by polymorphic XPC and XPD/ERCC2 genotypes / Y. Qiao, M.R. Spitz, H. Shen et al. // Carcinogenesis. 2002. Vol. 23. P. 295-299.
30. Wei Q. DNA repair and aging in basal cell carcinoma: a molecular epidemiology study / Q.Wei, G.M. Matanoski, E.R. Farmer, M.A. Hedayati, L. Grossman // Proc Natl Acad Sci USA. 1993. Vol. 90. P. 1614-1618.
31. Winsey S.L. A variant within the DNA repair gene XRCC3 is associated with the development of melanoma skin cancer / S.L. Winsey, N.A. Haldar, H.P. Marsh et al. // Cancer Res. 2000. Vol. 60. P. 5612-5616.